Microbiological and Molecular Genetic Studies on the Prevalence and Mechanisms of Resistance to Beta-Lactams and Quinolones in Clinically Relevant Enterobacter Spp. // Микробиологични и молекулярно-генетични проучвания върху разпространението и механизмите на резистентност към бета-лактами и хинолони при клинично значими Enterobacter spp.

Abstract

Целта на настоящия дисертационен труд е да се проучат видовия състав, чувствителността и механизмите на резистентност към бета-лактами и хинолони при клинично - значими изолати Enterobacter spp., колекционирани в УМБАЛ’’ Света Марина’’ – Варна за периода 2014 - 2017 г., както и да се определи клоналната свързаност на изолатите. Във връзка с това бяха проучени сто седемдесет и пет клинични изолата, изолирани в периода март 2014 г.- януари 2017 г. в УМБАЛ '' Света Марина'', Варна. В проучването беше включен и един изолат E. cloacae от болнична среда. Анализът на резултатите, получени в нашите изследвания и съпоставката им с литературната информация ни дават основание да направим следните изводи: 1) Изследваните изолати Е. cloacae complex принадлежаха в 99.2% към вида E. hormachaei. Конвенционалните методи за идентификация и в частност автоматизираната система Phoenix100 няма достатъчна дискриминираща сила да разграничи видовете от E. cloacae complex. Нsp60 секвенирането е бърз и специфичен метод за идентификация и разграничаване на видовете в Enterobacter cloacae complex. 2) Установихме високо ниво на резистентност (57%) към цефалоспорини от III-та генерация в проучваната колекция от изолати, както и високо ниво на резистентност към най-често използваните антимикробни лекарствени препарати в клиничната практика: piperacillin/tazobactam, ceftazidime, ciprofloxacin и gentamicin. След карбапенемите imipenem и meropenem, с най - голяма активност срещу Enterobacter spp. се отличава amikacin. 3) Проведените фенотипни методи за детекция на ESBLs при клинични изолати Enterobacter spp. показаха незадоволителна чувствителност. 4) Чрез молекулярно-генетични изследвания доказахме, че резистентността към цефалоспорини от III-та генерация сред изолатите Enterobacter spp. се дължи на наличие на ESBLs ензими в над 85%, с водещото значение на CTX-M-15 за Е. cloacae complex и CTX-M-3 ESBLs за E. aerogenes. При единични изолати установихме продукция на SHV-12 ESBL. При изолатите без продукция на ESBLs резистентността се дължи най-вероятно на хиперпродукцията на AmpC ензими. Само при един изолат бе доказана продукция на DHA-1 ензим. 5) Конюгационните експерименти доказаха плазмидната локализация на ESBLs гените и PMQR и потвърдиха приноса им за развитие на резистентност към цефалоспорини от III-та генерация и селектиране на хинолонова резистентност. 6) Епидемиологичното проучване установи широка вътреболнична дисеминация и трайно присъствие на един основен клон (клон А) E. cloacae complex с изразен инвазивен потенциал. При микробиологичното изследване на болнична среда бе доказан изолат E. cloacae complex, генетично идентичен (клон А, ERIC тип Аа) с клинични изолати от различни клиники на болницата. 7) В 59% от изследваните изолати Enterobacter spp. установихме наличие на PMQR с доминиране на qnrB (90%) и сравнително слабо разпространение на qnrA, qnrS и aac(6')-Ib-cr (единични изолати). QnrB се асоциира с продукция на CTX-M-15, qnrA - с SHV-12, а qnrS - с продукция на CTX-M-3. Единственият изолат с алел qnrB4 продуцира CTX-M-3 и DHA-1. В над 50% от изолатите доказахме наличие на хромозомни мутации за gyrA и parC гените.

This study aims to investigate the species composition, sensitivity and mechanisms of resistance to beta-lactams and quinolones in clinically significant isolates of Enterobacter spp., collected at St. Marina University Hospital - Varna for the period 2014-2017., as well as to determine the clonal relationship of the isolates. One hundred and seventy-five clinical isolates, isolated between March 2014 and January 2017 at St. Marina University Hospital - Varna, were investigated. The study also included an E. cloacae isolate from a hospital environment. The analysis of the results obtained in our research and its comparison with the literature gives us the reason to draw the following conclusions: 1) The examined isolates E. cloacae complex belonged to 99.2% of the species E. hormaechaei. Conventional identification methods, particularly the Phoenix100 automated system, do not have sufficient discriminatory power to distinguish the species in the E. cloacae complex. Hsp60 sequencing is a rapid and specific method for identification and distinguishing species in Enterobacter cloacae complex. 2) We found a high level of resistance (57%) to third-generation cephalosporins in the studied isolates as well as a high level of resistance to the most commonly used antimicrobial drugs in the clinical practice: piperacillin/tazobactam, ceftazidime, ciprofloxacin and gentamicin. Following the carbapenem imipenem and meropenem, the highest activity against Enterobacter spp. was amikacin. 3) The phenotypic methods for detecting ESBLs in clinical isolates of Enterobacter spp. showed unsatisfactory sensitivity. 4) Molecular genetic studies have shown resistance to third-generation cephalosporins among Enterobacter spp. isolates are due to the presence of ESBLs enzymes in over 85%, with the leading importance of CTX-M-15 for E. cloacae complex and CTX-M-3 ESBLs for E. aerogenes. In single isolates, we detected SHV-12 ESBL production. In non-ESBLs-producing isolates, resistance is most likely due to the hyperproduction of AmpC enzymes. Only one isolate has been shown to produce the DHA-1 enzyme. 5) Conjugation experiments demonstrated the plasmid localization of the ESBLs genes and PMQR and confirmed their contribution to the development of resistance to third-generation cephalosporins and selection of quinolone resistance. 6) The epidemiological study found extensive intra-hospital dissemination and long-term presence of one major clone (clone A) of E. cloacae complex with pronounced invasive potential. The microbiological study of the hospital environment proved E. cloacae complex identical (clone A, ERIC type Aa) with clinical isolates from different hospital units. 7) In 59% of Enterobacter spp. we found a presence of PMQR with qnrB dominance (90%) and a relatively low prevalence of qnrA, qnrS and aac (6') - Ib-cr (single isolates). QnrB was associated with CTX-M-15, qnrA - with SHV-12, and qnrS - with CTX-M-3. The only isolate with the qnrB4 allele produces CTX-M-3 and DHA-1. In over 50% of the isolates, we have shown chromosomal mutations for the gyrA and parC genes.