Angiogenesis in Glial Brain Tumors // Ангиогенеза при глиални мозъчни тумори

Abstract

Ангиогенеза, разрастване на нови кръвоносни съдове, е т. нар. „общ знаменател“, споделян от множество заболявания засягащи над един милиард хора по света. Това са всички злокачествени заболявания, сърдечно-съдови заболявания, слепота, артрити, усложнения от СПИН, диабет, болест на Алцхаймер и повече от 70 други здравословни проблеми засягащи деца и възрастни в развитите и развиващите се страни. В епохалната си публикация през 1971г., Folkman J, разви идеята, че туморният растеж е ангиогенно зависим и описва за първи път възможните перспективи на анти-ангиогенната терапия при онкологичните заболявания. Оттогава бяха нужни 13 години за идентифицирането на първият хепарин-свързващ растежен фактор, fibroblast growth factor (FGF)-2 и 18 години за откриването на vascular endothelial growth factor (VEGF). Въпреки изминалите над 40 години, все още няма утвърдени туморни маркери приложими при пациенти страдащи от глиални тумори. Множество съобщени циркулиращи биомаркери имат потенциал, но нито един не е доказан, за да бъде въведен в клиничната практика, независимо от спешността и необходимостта за стандатизиране на измерванията на ефекта от лечението в ежедневната клинична практика и проучвания. Здравият организъм контролира процеса на ангиогенеза, чрез редица “on” - ”off” превключвания. Главните “on” елементи са известни като – angiogenesis- stimulating growth factors. Главните “off” елементи са известни като- angiogenesis inhibitors. При здравият организъм се поддържа перфектно равновесие от ангиогенни модулатори. Съществуват най-малко 20 ангиогенни растежни фактора. Пет са тествани върху хора за стимулиране на растежа на нови кръвоносни съдове, за зарастване на рани и възстановяване на кръвотока към сърце, крайници и мозък. Първият ангиогенен инхибитор е открит през 1975г. От Dr. Judah Folkman и Dr. Henry Brem. До днес са открити около 30 ангиогенни инхибитора в човешкото тяло, а общо са над 300 в естествени източници- гъби, дървесни кори, мускул и хрущял от акула, корали, зелен чай, чесън, жен-шен, билки и др. VEGF и рецепторите му 1 и 2 са сред основните звена в туморната ангиогенеза, а bFGF е първата изолирана проангиогенна молекула. VEGF (vascular endothelial growth factor), VPF (vascular permeability factor) или vasculotropin. Глюкопротеин e открит в туморни клетки при редица гризачи и хора - карцином на бял дроб и пикочен мехур, фибросарком, промиелоцитна левкемия, лимфоми и глиални тумори. В здрави тъкани се открива в активирани макрофаги, кератиноцити, хепатоцити, гладкомускулни клетки, епитела на бронхи и плексус хороидеус. Той е специфичен митоген за ендотелните клетки – не е митоген за други типове клетки. Медиира секрецията и активацията на ензими участващи в разграждането на ектрацелуларния матрикс, анти-апоптозен фактор за ендотелните и туморните клетки. VEGF е незаменим за организирането и набирането на прекурсорите на ендотелните клетки от костния мозък и организация на васкуларизацията, модулира миграцията на ендотелните клетки. Експресията му се стимулира от хипоксия, която е главния “дразнител”. In vivo индуцира процеса на ангиогенеза едновременно с микроваскуларния пермеабилитет. bFGF е първата проангиогенна молекула, изолирана през 1984г. от Shing от хондросарком. FGF модулира нормални процеси като ангиогенеза, зарастване на рани, учене, памет, както и ембрионалното развитие на сърцето, костите и мозъка, неадекватната му експресия или други членове на семейството на FGF резултира в туморна прогресия. Тези феномени водят до извода, че семейството на FGF може би взема активно участие в редица патологични състояния в резултата на неконтролирана клетъчна пролиферация и неконтролируема ангиогенеза. FGF-индуцира невронална диференциация, преживяемост, регенерация и предпазва невроните от т. нар. лезионно индуцирана смърт („lesion-induced death“). Стимулира не-митогенните функции на глиалните клетки като миграцията и е установен в зони на хипокампус, мозъчен ствол и периферни ганглии Материал и методи : В настоящето проучване са обхванати и анализирани общо 109 пациента, при които е проведено неврохирургично лечение, чрез краниотомия и резекция на мозъчна неоплазма за периода 2006-2013 г. Пациентите са разделени в две главни групи – при 25 от пациентите са изследвани плазмените концентрации на VEGF и bFGF, при 64 от пациентите са изследвани ликворните нива на VEGF. Включени са злокачествени първични мозъчни неоплазми от различни нозологични единици, като се оформят две групи: Нискостепенни и Високостепенни глиоми. Контролни групи- 20 пациента, клинично здрави, без данни за хронични заболявания и група от 11 пациенти с доброкачествени новообразувания- Менингиом. В динамика са проследени общо 14 болни, които са анализирани пред и постоперативно ( в ранният постоперативен период - 7 ден). Всички пациенти са хистологично диагностицирани, като при тези с глиални тумори е регистриран летален изход до края на анализирания период (Декември, 2013 г.), за разлика от контролните групи, при които смъртността е 0%. Специфични методи на изследване: ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) методика за изследване концентрацията на свободните форми VEGF и bFGF в плазма и ликвор. Статистически анализи: Дискриптивен анализ, Kruskal-Wallis Test, Kolmogorov–Smirnov Test, Student t-test, Корелационен анализ, Kaplan–Meier Test, Мултипараметричен анализ, Cox регресионен модел Резултати: При изследване на VEGF в ликвор се установи, че коефициента на Пирсън варира в рамките на минус 0.15-0.30- умерена отрицателна зависимост- с увеличаване стойностите на фактора преживяемостта бавно ще намалява (приблизително на 100 единици увеличаване на фактора се очаква намаляване на преживяемостта с 5-25 дни). Според всички резултати модела е значим (t теста на Стюдънт, p=0.05) и устойчив. Може да се очаква, че и при изследването на по-голяма група пациенти резултатите ще са сходни с получените, което ни дава възможност да обобщим резултатите и да изведем окончателна формула: дни живот = -0.088 . (стойност на VEGF в ликвор) + 213 Стойностите 0.088 и 213 са коефициенти екстраполирани от регресионния анализ следствие устойчивостта на модела. Измерената стойност на VEGF фактора се замества на мястото и получения резултат е приблизителния брой дни живот. Изводи 1. От междугруповия анализ на представените мозъчни неоплазми и контролните групи, се установи статистически достоверно увеличена степен на ликворна експресия на VEGF при високостепенни глиални тумори. 2. Установи се отрицателна зависимост между ликворната експресия на VEGF и продължителността на живота при пациенти с мултиформен глиобластом, която е слабо отрицателна при мъжете и три пъти по-изразена при жените, т.е. при жените големината на фактора влияе по-силно на продължителността на живота, отколкото при мъжете. 3. Кръвно-мозъчната бариера е важен фактор в разпределението на VEGF и bFGF в тъканните течности. 4. Плазмената експресия на VEGF и bFGF не корелира с хистологичния вид на тумора, степента на малигненост и продължителността на живота. 5. Плазменият ангиогенен профил, включващ VEGF и bFGF, е лесно достъпен индиректен метод за отразяване на ангиогенезата, но не е приложим при изследваните групи мозъчни неоплазми. 6. Отчетените постоперативно, повишени нива на VEGF и bFGF, не корелират с обема на туморната резекция, вида или степента на малигненост на тумора и най-вероятно са израз на физиологична регенерация индуцирана от оперативната рана. 7. Комплексният подход с прогностична цел при пациентите с глиални мозъчни тумори, включващ ликворна диагностика на VEGF и многофакторна оценка на постоперативното лечение превъзхожда самостоятелното използване на отделни прогностични критерии и фактори. Приноси: 1. За първи път, според достъпната литература, се изследват растежните фактори VEGF и bFGF при пациенти с мозъчни тумори в толкова голяма серия пациенти, даваща статистическа достоверност. 2. За първи път, според достъпната литература, се установява независимото прогностично значение и влиянието на ликворните нива на VEGF върху продължителността на живота. 3. За първи път, според достъпната литература, е създаден регресионен нелинеен математически модел на зависимостта между стойностите на VEGF и продължителността на живота измерена в дни и въз основа на това е изведена формула за определяне на евентуалната продължителност на живота при пациенти с мултиформен глиобластом. 4. За първи път в страната се изследват растежните фактори VEGF и bFGF при пациенти с мозъчни тумори. 5. За първи път в страната е осъществен комплексен ангиогенен анализ, включващ плазмена и ликворна оценка на VEGF и bFGF концентрации при три групи мозъчни тумори и група от здрави пациенти. 6. За първи път в страната се съпоставят концентрациите на VEGF и bFGF при доброкачествени и злокачествени първични мозъчни неоплазми. 7. За първи път в страната се оценява корелацията между експресията на VEGF и bFGF в ликвор и плазма и продължителността на живота. 8. Установи се, че плазмените нива на VEGF и bFGF не дават информация за вида, степента на малигненост на неоплазмата или продължителността на живота. 9. Създадена е анкетна карта за катамнезно проучване. 10. Проведено е целенасочено проучване за установяването на продължителността на живота. 11. Определя се високата прогностична стойност на ликворната експресия на VEGF като евентуален маркер за оценка на очакваната продължителност на живота.

Angiogenesis or the growth of new blood vessels, is the so-called ‘common denominator’ shared by many diseases, affecting more than a billion people worldwide. These are all malignant diseases, heart disease, blindness, arthritis, complications of AIDS, diabetes, Alzheimer's disease, and more than 70 other health problems affecting adults and children in both developed and developing countries. In his landmark publication in 1971, Folkman J, develops the idea, that tumor growth is angiogenesis-dependent and describes for the first time the possible prospects of anti-angiogenic therapy in cancer. It took 13 years since then for the identification of the first heparin-binding growth factor, fibroblast growth factor (FGF) -2 and 18 years for the detection of vascular endothelial growth factor (VEGF). However, in spite of more than 40 years of research, no tumor marker useful for patients with gliomas is established yet. Many reported circulating biomarkers have the potential but none has proven to be introduced into clinical practice, despite the urgency and the need to standardize the measurement of the effect of treatment in daily clinical practice and research. Healthy body controls the process of angiogenesis through a number of "on" - "off" switches. The main "on" elements are known as - angiogenesis- stimulating growth factors. The main "off" elements are known as - angiogenesis inhibitors. The healthy individuals maintain a perfect balance of angiogenic modulators. There are at least 20 known angiogenic growth factors. Five are tested on people for stimulating growth of new blood vessels in wound healing and restoration of blood flow to the heart, brain and limbs. The first angiogenesis inhibitor is detected in 1975 by Dr. Judah Folkman and Henry Brem. Today about 30 angiogenic inhibitors are to be found in the human body and generally more than 300 in natural sources - fungi, bark, muscle and shark cartilage, coral, green tea, garlic, ginseng, herbs and more. VEGF and its receptors 1 and 2 are the main units in tumor angiogenesis and bFGF was first isolated pro-angiogenic molecule. VEGF (vascular endothelial growth factor), VPF (vascular permeability factor) or vasculotropin. Glycoprotein found in a number of tumor cells in rodents and humans - carcinoma of the lung and bladder, fibrosarcoma, promyelocytic leukemia, lymphomas and gliomas. In healthy tissue it is found in activated macrophages, keratinocytes, hepatocytes, smooth muscle cells, the epithelium of bronchi and choroid plexus. It is a specific mitogen for endothelial cells; it is not a mitogen for the other cell types. Mediated secretion and activation of the enzymes involved in the degradation of the extracellular matrix, anti-apoptotic factor for endothelial and tumor cells. VEGF is essential for organizing and recruitment of endothelial progenitor cells from bone marrow and organization of vascularization, modulates migration of endothelial cells. Its expression is stimulated by hypoxia, which is the primary ‘stimulus’. In vivo induced angiogenesis processes simultaneously microvascular permeability. bFGF is the first pro-angiogenic molecule isolated in 1984 by Shing from chondrosarcoma. FGF modulate normal processes such as angiogenesis, wound healing, learning, memory, and embryonic development of the heart, bones and brain, its inadequate expression or other members of the FGF family results in tumor progression. These phenomena lead to the conclusion that the FGF family can be actively involved in a number of pathological conditions as a result of uncontrolled cell proliferation and uncontrolled angiogenesis. FGF-induced neuronal differentiation, survival, regeneration and protects neurons against so-called ‘lesion-induced death’. It stimulates non-mitogenic functions of glial cells such as migration and is established in the areas of hippocampus, brainstem and peripheral ganglia. MATERIALS and METHODS: Subject to research and analyses in the present study are 109 patients whose treatment was conducted by craniotomy and resection of the brain neoplasm within a period of six years. Patients are divided into two main groups - 25 patients tested plasma concentrations of VEGF and bFGF, in 64 of the patients CSF levels of VEGF are investigated. Included are malignant primary brain neoplasms of various nosological units and form two groups: low grade and high grade glioma. Control groups-20 patients, clinically healthy without evidence of chronic diseases and a group of 11 patients with Meningioma. In dynamics 14 patients are analyzed pre- and postoperatively (in the early postoperative period - 7 days). All patients are histologically diagnosed. Those with gliomas are lethally registered before the end of the analyzed period (December, 2013), in contrast to control groups, in which the mortality is 0%. SPECIFIC RESEARCH METHODS: ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) method for testing the concentration of free VEGF and bFGF forms in plasma and CSF. STATISTICAL ANALYSIS: Descriptive analysis, Kruskal-Wallis Test, Kolmogorov-Smirnov Test, Student t-test, correlation analysis, Kaplan-Meier Test, Multiparametric analysis, Cox regression model RESULTS: In a study of VEGF in the CSF is established that the coefficient of Pearson varies with negative dependency 0.15-0.30 to moderate negative with increasing values of the survival factor slowly decreases (approximately every 100 ngr of VEGF are expected to decrease survival within period of 5 -25 days). According to the results the model is significant (t Student test, p = 0.05) and stable. It can be expected that the study of a larger group of patients will be similar to that obtained, which enables us to generalize the results and bring to a final formula: Days of life = -0.088. (Value of VEGF in CSF) + 213 Values 0088 and 213 are extrapolated coefficients from the regression analysis result the sustainability of the model. The measured value of VEGF factors substitute itself in place and the result is the approximate number of days of life. CONCLUSIONS: 1. The intergroup analysis of brain neoplasms presented and the control groups statistically significant increased levels of CSF VEGF expression in high grade gliomas are found. 2. Negative correlation between CSF expression of VEGF and the life expectancy of patients with glioblastoma multiform is established, which is slightly negative in men and with three times higher expression in female, i.e. women size factor affects more life expectancy than men. 3. Blood-brain barrier is an important factor in the distribution of VEGF and bFGF in tissue fluids. 4. The plasma expression of VEGF and bFGF is not correlated with the histological type of the tumor, the degree of malignancy and longevity. 5. The plasma angiogenic profile, including VEGF and bFGF, is easily accessible indirect method to reflect angiogenesis, but is not applicable to the groups of brain neoplasms. 6. The reported postoperatively, increased levels of VEGF and bFGF, is not correlated with the volume of tumor resection, the type or degree of malignancy of the tumor and most likely expression of physiological regeneration induced by the surgical wound. 7. The integrated predictive approach for patients with glial brain tumors, including CSF diagnosis of VEGF and multifactorial assessment of postoperative treatment is superior to the use of separate independent prognostic criteria and factors. CONTRIBUTIONS 1. Growth factors VEGF and bFGF in patients with brain tumors in such a large series of patients providing statistical reliability, are examined for the first time, as per the available literature. 2. Independent prognostic significance and the impact of CSF levels of VEGF on longevity are established for the first time, as per the literature available. 3. Regression nonlinear mathematical model of the relationship between the values of VEGF and the life expectancy measured in days is created. Based on it a formula is derived to determine the life expectancy in patients with glioblastoma multiforme. This is done for the first time as per the literature available. 4. Growth factors VEGF and bFGF in patients with brain tumors are tested for the first time in the country. 5. Complex angiogenic analysis including plasma and CSF evaluation of VEGF and bFGF levels in three groups of brain tumors and a group of healthy subjects is made for the first time in the country. 6. The concentrations of VEGF and bFGF in benign and malignant primary brain neoplasms are compared for the first time in the country. 7. The correlation between the expression of VEGF and bFGF in CSF and plasma and longevity is assessed for the first time in the country. 8. It is established that plasma levels of VEGF and bFGF do not provide information on the type, the degree of malignancy of a neoplasm or life expectancy. 9. A questionnaire for katamnestic study is created. 10. Targeted research to establish the longevity is performed. 11. The high prognostic value of CSF VEGF expression as a possible marker for the assessment of life expectancy is determined.